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| | Nachweis | Kein Nachweis verfügbar |
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| EcPOX; FAD; ThDP; limitierte Proteolyse; Aktivierung; Elektrontransfer; Konformationsänderung; Kristallstrukturanalyse | |
| EcPOX; FAD; ThDP; limited proteolysis; activation; electron transfer; conformational change; Xray structure | |
| Das thiamin- und flavinabhängige periphere Membranenzym Pyruvatoxidase aus E. coli (EcPOX) katalysiert die oxidative Decarboxylierung des zentralen Metabolits Pyruvat zu CO2 und Acetat unter gleichzeitiger Reduktion von Ubichinon-8 einem mobilen Elektronenüberträger der Elektronentransportkette. Assoziation von EcPOX an die Zellinnenmembran in vivo oder limitierte Proteolyse in vitro erhöhen die katalytische Effizienz des Enzyms deutlich. In der vorliegenden Arbeit wurde der molekulare Mechanismus der Aktivierung mittels spektroskopischer elektrochemischer und kristallographischer Methoden untersucht. Kristallstrukturen des Volllängenenzyms und einer proteolytisch aktivierten Variante die am CTerminus um 23 Reste verkürzt ist zeigten dass im Zuge der Aktivierung zwei Konformationsänderungen stattfinden deren Konsequenz die Exposition des autoinhibitorischen CTerminus ist. In der Kristallstruktur der nicht-aktivierten EcPOX verschliessen die α-helikal gefalteten Reste 536-544 das aktive Zentrum. Diese Helix wird in der Struktur der proteolytisch aktivierten Variante nicht ausgeprägt. Infolgedessen wird die Lösungsmittelzugänglichkeit des aktiven Zentrums erhöht. Vergleichende kinetische Untersuchungen an nicht-aktivierter und aktivierter EcPOX belegen dass die Erhöhung der Zugänglichkeit des aktiven Zentrums einen wesentlichen Beitrag zur Erhöhung der katalytischen Effizienz infolge der Aktivierung leistet. Zudem konnte durch Aufnahme von Transientkinetiken der FAD-Reduktion sowie NMR-basierte Intermediatsanalyse gezeigt werden dass die Bildung des ersten kovalenten Intermediates im katalytischen Zyklus Laktylthiamindiphosphat ein mechanistisches Target der Aktivierung ist. Kristallographische Studien in Gegenwart des Substrates Pyruvat bestätigen diesen Befund. Darüberhinaus zeigen Untersuchungen an Varianten die mittels ortsgerichteter Mutagenese erhalten wurden dass Phe465 im aktiven Zentrum nach der Aktivierung zwischen beide Kofaktoren schwingt wodurch der Elektronentransfer beschleunigt wird. Der isolierte C-Terminus (α-Peptid) welcher intrinsisch keine α-helikale Struktur aufweist nimmt in Gegenwart von SDS-Mizellen eine helikale Struktur an. |
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