Molekulare und biochemische Analysen der frühen pflanzlichen Embryogenese werden durch physikalische Unzugänglichkeit und minimale Größe des zygotischen Embryos limitiert. Alternative Experimentalmodelle liefern somatische Embryogenesesysteme, da Entwicklungsstadien somatischer und zygotischer Embryonen Ähnlichkeiten in Morphologie und zellulären Differenzierungsprozessen aufweisen. Als somatisches Embryogenesesystem wurde die direkte somatische Embryogenese von Nicotiana plumbaginifolia genutzt. Embryogeneseinduktion erfolgte an in vitro kultivierten Mesophyllprotoplasten, die ohne intermediäre Kallusbildung mit hoher Frequenz zu somatischen Embryonen differenzieren, aus denen Ganzpflanzen regenerieren. Zur Isolierung von Genen, die in frühen Embryogenesestadien induziert werden bzw. hohe Transkriptionsaktivität aufweisen, wurden die differentiellen Selektionstechniken DDRT-PCR (differential display reverse transcription-PCR) und subtraktive Hybridisierung eingesetzt. RT-PCR und genomische PCR wurden zur gezielten Isolierung von cDNA-Sequenzen für heterotrimere G-Proteine eingesetzt, um experimentelle Daten für ihre Beteiligung am Embryogeneseprozeß zu ermitteln. Aus einer λZAP-ExpressTM-cDNA-Bank, hergestellt aus mRNA-Populationen früher Embryogenese-stadien von N. plumbaginifolia, wurden die korrespondierenden vollständigen cDNA-Klone isoliert. Zur Charakterisierung der isolierten Gensequenzen wurden Entwicklungs-abhängigkeit und Gewebespezifität von RNA- und Proteinexpression, hormon- und streßabhängige Regulation der Transkriptgehalte, Gewebespezifität und intrazelluläre Kompartimentierung der Proteine während der Samenentwicklung und Effekte der Transgenexpression auf RNA- und Proteinebene sowie auf die Pflanzenentwicklung untersucht. Der cDNA-Klon c41-3 kodiert ein dem generellen Transkriptionsfaktor BTF3 homologes Protein, dessen korrespondierende mRNA zwar ubiquitär, jedoch mit Präferenz für frühe Embryogenesestadien exprimiert wird. Der cDNA-Klon pNLA35 kodiert vermutlich die größte Untereinheit des Translationsinitiationsfaktors 3 aus N. tabacum. In N. plumbaginifolia wurde ein homologes Transkript in embryogenen Stadien und Blättern sowie das entsprechende Protein in Embryo- und Endospermzellen nachgewiesen. DNA- und Proteinsequenz des cDNA-Klons Np22c28 wiesen keine Homologien zu bekannten Datenbank-Sequenzen auf. Vorrangige mRNA-Akkumulation in frühen somatischen Embryogenesestadien und immun-histologischer Nachweis in Samenanlagen während der frühen zygotischen Embryogenese lassen Funktionalität im Embryogeneseprozeß vermuten. Die cDNA-Klone 3Sar und 50Sar kodieren verwandte Sar1-homologe kleine GTP-bindende Proteine. Sie wurden ubiquitär exprimiert und waren intrazellulär membranassoziiert oder vorrangig in Speichervakuolen von Endospermzellen nachzuweisen. Vermutlich sind sie an Vesikeltransportprozessen in allen metabolisch aktiven Zellen und Geweben beteiligt. Die cDNA-Klone βl12/1 und βl3/2 wurden als verwandte WD40-Proteine der RACK1-Subfamilie identifiziert. Sie wurden ubiquitär, aber mit Präferenz für embryogene und teilungsaktive Zellen exprimiert und könnten an Zellteilungsprozessen beteiligt sein. Die cDNA-Klone α2/4 und β16/1 kodieren für eine G-Protein-α- bzw. β-Untereinheit. Ubiquitäre Expression, subzellulare Lokalisierung in Embryo- (überwiegend membranassoziiert) und Endospermzellen sowie Hormontests lassen Funktionen nicht nur in der Embryogenese, sondern in zahlreichen zellulären Prozessen vermuten. Aufgrund von Gemeinsamkeiten und Unterschieden in den mRNA-Expressionsmustern wird angenommen, daß beide Proteine sowohl konzertiert als auch unabhängig voneinander agieren. Keiner der isolierten cDNA-Sequenzen kann Embryogenesespezifität zugeordnet werden. Vermutlich kodieren sie essentielle Proteine von Zellteilungs- und/oder -differenzierungsprozessen und weisen demzufolge in den mitotisch aktiven und differenzierungsintensiven Zellen des Embryos hohe Transkriptgehalte auf. In allen Versuchen mit transgenen antisense- oder Kosuppressions-Pflanzen wurde statt reduzierter, erhöhte Expression der endogenen Transkripte für Gα, Gβ und das WD40-Protein nachgewiesen. Diese Überexpressionseffekte blieben in den nachfolgenden Pflanzengenerationen erhalten, führten jedoch zu keinen phänotypischen Veränderungen. |