Die massive, transiente Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (oxidative burst) ist eine wichtige Komponente der pflanzlichen Pathogenabwehr. Die molekularen Mechanismen, die zur Entstehung des oxidative burst in Pflanzen führen, sind noch nicht aufgeklärt. Es wurden zwei cDNA Klone, rboh1 und rboh2 (respiratory burst oxidase homolog) isoliert, deren abgeleitete Aminosäuresequenzen signifikante Homologien zur katalytischen Untereinheit der NADPH-Oxidase aus Säuger-Phagozyten, GP91phox, aufweisen. In Phagozyten wird die Produktion von Superoxidanionen (respiratory burst) durch einen multimeren NADPH-Oxidase-Komplex katalysiert und dient der direkten Bekämpfung eingedrungener Erreger. Durch heterologe Expression der RBOH-Proteine in der Hefe Saccharomyces cerevisiae konnte in den mikrosomalen Fraktionen der Hefen NAD(P)H-abhängige O2--Produktion detektiert werden. Es wurde gezeigt, dass die O2--Bildung in RBOH2-Hefemikrosomen unabhängig von der Anwesenheit von Ca2+ war. Hingegen wurde in RBOH1-Hefemikrosomen unter Verwendung eines Ca2+-haltigen Extraktionspuffers Enzymaktivität nachgewiesen. Übereinstimmend damit enthält die RBOH1-Aminosäuresequenz mindestens ein putatives Ca2+-bindendes EF-Hand-Motif. Die Enzymaktivität der rekombinanten RBOH-Proteine wurde durch den Flavin-Oxidase-Hemmstoff DPI inhibiert. Die Applikation ähnlicher Konzentration DPI hemmt in vielen Pflanze/Pathogen-Systemen die Produktion von ROS und nachfolgenden Abwehrreaktionen. In Petersiliezellkulturen wurde nach Behandlung mit einem pilzlichen oder bakteriellen Elicitor ein transienter 3 bis 5facher Anstieg der rboh2-Transkriptmenge mit einem Maximum nach 2 Stunden detektiert. Untersuchungen mit stabil transformierten rboh2-Sense-Zellkulturen lieferten erste Hinweise auf eine physiologische Rolle der RBOH-Proteine innerhalb des oxidative burst. Da keine rboh2-Antisense-Kulturen generiert werden konnten, in der die rboh2-Transkriptakkumulation vollständig unterdrückt war, sind weitere Experimente zur Funktionsaufklärung notwendig. In dieser Arbeit gelang es erstmals einen funktionalen Zusammenhang zwischen pflanzlichen Genen mit Homologie zu gp91phox und einer von vielen Arbeitsgruppen postulierten NADPH-Oxidaseaktivität der kodierenden Proteine herzustellen. |