Die cus-Determinante von Escherichia coli ist eines von drei chromosomal kodierten Systemen, die an der Kupferhomöostase beteiligt sind. Das cusCFBA-Operon kodiert für die Proteine CusCBA, die eine Entgiftung von Kupfer und Silber wahrscheinlich durch Efflux vermitteln, sowie ein neuartiges Protein CusF. Es konnte gezeigt werden, dass cusB und cusA essentiell, für die cus-vermittelte Kupferresistenz sind. Für die Vermittlung der vollen Kupferresistenz ist aber auch das Vorhandensein von cusC und cusF notwendig. Bei CusA handelt es sich um das zentrale Transportprotein des CusCBA-Efflux-Komplexes. Über Aminosäureaustausch-Mutationen konnten periplasmatisch lokalisierte Methioninreste, M573, M623 und M672, identifiziert werden, die als mögliche Substratbindestellen wichtig für die cus-vermittelte Kupferresistenz sind. Weitere Methioninreste hatten keinen Einfluss auf die Kupferresistenz. Es konnte gezeigt werden, dass das Vorhandensein geladener Aminosäurereste in der Transmembran-Helix IV von CusA wichtig für die Funktion des Proteins ist. Das neuartige Protein CusF ist periplasmatisch lokalisiert. Unter Verwendung CusF-spezifischer polyklonaler Antikörper konnte CusF im periplasmatischen Extrakt von Escherichia coli nach Inkubation mit Cu2+ nachgewiesen werden. Das gereinigte CusF-Protein band in vitro ein mol Kupfer pro mol Protein. CusF wies nach Kupferbindung eine pink-violette Färbung auf und zeigte im UV/vis-Spektrum ein Maximum bei ca. 510 nm. Über Aminosäureaustausch-Mutationen konnte gezeigt werden, dass die Methioninreste M69 und M71 wichtig für die Kupferbindung und somit für die Funktion von CusF sind. Weitere Aminosäurereste, als potentielle Liganden des Kupfers, hatten keinen Einfluss. Unter Verwendung des Yeast-Two-Hybrid-Systems konnte eine Interaktion von CusF mit den Proteinen CusC und CusB des CusCBA-Efflux-Komplexes nachgewiesen werden.
|