Phospholipasen A2 (PLA2) spielen eine entscheidende Rolle bei der Produktion von Lysophospholipiden. Gegenwärtig wird die PLA2 aus dem Schweinepankreas für diese Applikation eingesetzt. Um das Enzym aus dem Schweinepankreas ersetzen zu können, wurde ein synthetisches Gen erzeugt, welches sich von der PLA2 aus der Honigbiene ableitet. Das synthetische Gen wurde in Escherichia coli exprimiert. Da die Expression mit einer Leadersequenz, die zur Sezernierung des Proteins ins Periplasma führen sollte, scheiterte, wurden vier Genvarianten hergestellt und exprimiert, deren N-terminale Sequenz modifiziert wurde. Alle Varianten wurden in Form von inclusion bodies mit einer Ausbeute von 26 bis 35% als Anteil am Gesamtzellprotein exprimiert. Nach der Optimierung der Renaturierung wurden die rekombinanten Proteinspecies durch Kationenaustauschchromatographie (Mono S) gereinigt. Alle Varianten waren katalytisch aktiv. Die rekombinanten PLA2-Formen zeigten eine dem Bienengiftenzym vergleichbare Struktur (Fern-UV-CD-Spektren, Fluoreszenzemissionsspektren). Die thermodynamische Stabilität der rekombinanten PLA2s im Vergleich zum Bienengiftenzym zeigt keine gravierenden Unterschiede. Nach der Optimierung des Expressionsprozesses in Schüttelkolben wurde ein Scale up der Produktion durch Hochzelldichtefermentation im 10 Liter Maßstab durchgeführt. Um den Einfluss der individuellen Disulfidbrücken auf die Proteinstabilität sowie Aktivität zu überprüfen, wurden Enzymvarianten erzeugt, in denen jeweils zwei Cysteinreste, die in der natürlich vorkommenden PLA2 Disulfidbrücken bilden, durch Serinreste ersetzt. Mit Ausnahme der Cysteinmutanten I1A/C9S/C31S-PLA2 I1A/C61S/C95S-PLA2 zeigten alle Mutanten nur einen moderaten Aktivitätsverlust. Beim Vergleich der Stabilität der Cysteinmutanten mit dem Wildtyp ergaben sich in Abhängigkeit von der Lokalisation der Disulfidbrücke sehr distinkte Stabilitätsunterschiede. Die Entfernung einer Disulfidbrücke führt zu einer unterschiedlich stark ausgeprägten Destabilisierung bei weitgehend erhaltener Kooperativität der Übergänge.
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