Die Thiamindiphosphat-abhängige Indolpyruvatdecarboxylase stellt in Enterobacter cloacae (EcIPDC) das Schlüsselenzym in der Biosynthese des Phytohormons Indolessigsäure dar und katalysiert die nichtoxidative Decarboxylierung von Indolpyruvat zu Indolacetaldehyd und Kohlendioxid. Neben dem physiologischen Substrat werden auch Pyruvat und Benzoylformiat umgesetzt. Röntgenkleinwinkelstreuexperimente mit Synchrotonstrahlung zeigten, dass das Apoenzym der EcIPDC ein pH-abhängiges Gleichgewicht zwischen Tetrameren und Dimeren bei niedrigen pH-Werten bzw. zwischen Dimeren und Monomeren bei höheren pH-Werten aufweist. Der Zusatz von Thiamindiphosphat resultiert in der Stabilisierung der tetrameren Form der EcIPDC. Die Kristallstruktur des Holoenzyms der EcIPDC wurde mit einer Auflösung von 2.65 Å bestimmt. Die Röntgenkristallstrukturanalyse zeigte, dass die homotetramere EcIPDC in ihrem Aufbau besonders den Thiamindiphosphat-abhängigen Pyruvatdecarboxylasen ähnelt. Die innerhalb der Klasse der Indolpyruvatdecarboxylasen und der Pyruvatdecarboxylasen hoch konservierten Aminosäurereste Asp29, Glu52, His115 und Glu468 (Nummerierung entsprechend EcIPDC) sind in der Nähe des Reaktionszentrums gelegen und können im Sinne ihrer Säure-Base-Eigenschaften einen Einfluss auf bestimmte Katalyseschritte nehmen. Ein wichtiger Unterschied in den aktiven Zentren von EcIPDC und PDC ist Gln383, welches in den Pyruvatdecarboxylasen durch ein Threonin ersetzt ist. Kinetische Untersuchungen und der 1H-NMR-spektroskopische Nachweis der in der Katalyse von Indolpyruvat, Pyruvat und Benzoylformiat gebildeten Reaktionsintermediate spezifisch konstruierter Aminosäureaustauschvarianten (Asp29Glu, Glu52Asp, His115Lys, Gln383Thr und Glu468Asp) dienten zur Identifizierung der an der Katalyse beteiligten Aminosäureseitenketten und funktionellen Gruppen des Cofaktors. Aufgrund der Verteilung der Intermediate im steady-state konnten mikroskopische Geschwindigkeitskonstanten einzelner Katalyseschritte berechnet werden. In der EcIPDC-Katalyse sind die kovalente Substratbindung und die Produktabspaltung partiell geschwindigkeitsbestimmend. Die Decarboxylierungsreaktion ist dagegen mindestens um eine Größenordnung schneller. Die Analyse 4-substituierter Benzoylformiate zeigte, dass die elektronischen Anforderungen der Substituenten die Stabilität der während der Katalyse gebildeten Intermediate beeinflussen. Die strukturellen und kinetischen Ergebnisse wurden zusammenhängend diskutiert und vergleichend zu verwandten Thiamindiphosphat-abhängigen Enzymen analysiert. Dabei unterstützen und erweitern die präsentierten Ergebnisse die vorgeschlagenen Reaktionsmechanismen der Benzoylformiatdecarboxylase und der Pyruvatdecarboxylase, sowie die Modellstudien relevanter Schlüsselintermediate.
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