L-Arginin ist ein Faltungsadditiv, das häufig eingesetzt wird, um die Effizienz von Proteinfaltungsprozessen zu erhöhen. Die Anwendung wurde zum ersten Mal in einer Patentveröffentlichung im Jahr 1985 beschrieben. Es zeigte sich, daß Arginin sehr für eine Vielzahl von Proteinen sehr wirksam ist, aber der zugrundelegende Wirkungsmechanismus wurde noch nicht bestimmt. Das Ziel dieser Arbeit war daher, den zugrundeliegenden Wirkungsmechanismus von Arginin zu ermitteln. Für die Versuche wurde Hühnereiweißlysozym als Modellprotein verwendet, für das während der Rückfaltung eine Konkurrenzreaktion zwischen Rückfaltung und Aggregation auftritt. In dieser Arbeit wurde die Wirkung von Arginin im Konzentrationsbereich 0-2 M zu Guanidinhydrochlorid (GdmCl) verglichen, das ebenso wie Arginin eine Guanidingruppe besitzt. Bei Zimmertemperatur üben beide Faltungsadditive auf die Sekundär- und Tertiärstruktur keinen Einfluß aus. In Gegenwart von GdmCl verringert sich die Temperaturstabilität von Lysozym, wohingegen Areginin nicht die Stabilität beeinflußt. Es wurden Temperaturübergangsmessungen in Gegenwart von Sulfhydrylverbindungen durchgeführt, die während des Rückfaltungsprozesses zugegeben werden müssen, um die Ausbildung der korrekten Disulfidbrücken während der Rückfaltung zu ermöglichen. Diese Verbindungen wurden zugesetzt, um den Proteinzustand während der Ruckfaltung zu simulieren. Während der Rückfaltung ist, ähnlich wie bei der Entfaltung, das Protein teilentfaltet, und die Sulfhydrylgruppen sind dem Lösungsmittel zugänglich. Unter diesen Bedingungen stabilisiert Arginin das Protein, was darauf hindeutet, daß es möglicherweise Faltungsintermediate stabilisiert. Es wurde gezeigt, daß beide Additive die Löslichkeit von denaturiertem Protein erhöhen, wohingegen das Auflösen von Aggregaten keine bedeutende Rolle spielt für die Faltungseffizienz beider Additive. Kinetische Konstanten für die Faltung und Aggregation wurden von Daten abgeleitet. Es zeigte sich, daß beide Additive die Aggregationsraten in ähnlicher Art und Weise beeinflußen. Die Faltungsraten ware leicht erhöht in Gegenwart von Arginin. ANS Fluoreszenzkinetiken wurden gemessen, die zeigten, daß sich Faltungsintermediate in Gegenwart von Additiven langsamer ausbilden. Wenn Arginin zu einem bereits laufenden Faltungsprozeß zugegeben wurden, zeigte sich, daß es von Anfang an anwesend sein. Dies wiederum zeigt, daß Arginin mit Faltungsintermediaten wechselwirken muß, um Aggregation zu unterdrücken. Ein neuartiger, reduktiver Aggregationsprozeß von Lysozym wurde beschrieben. Wenn Dithiothreitol (DTT) zu nativem Lysozym zugegeben wird, wurden Aggregate nach einer Verzögerungsphase beobachtet. Arginin und GdmCl können beide die Aggregation verringern. Der Aggregation vorausgehend wurde ein Verlust der enzymatischen Aktivität beobachtet, die durch Reduktion der Disulfidbrücken hervorgerufen wird. Ein Vergleich der Aktivitäts-, Aggregations- und ANS-Kinetiken zeigt, daß GdmCl Aggregation zu unterbinden scheint durch Erhöhung der Löslichkeit von Intermediaten und Aggregaten, wohingegen Arginin die Löslichkeit der Intermediate erhöht, und somit Aggregation verringert. |