Titelaufnahme

Ziele: Der Comet-Assay ist ein Messverfahren zur Quantifizierung von DNS-Schaden auf Einzellzellebene. Zellen einer Zellpopulation weisen im Comet-Assay verschiedene Schädigungsgrade auf. Anhand von experimentellen Modellen wurde überprüft, ob diese im Comet-Assay messbare Schadensheterogenität durch die Faktoren Chromatinstruktur/Histongehalt, Gehalt löslicher Antioxidantien, Bestrahlung und Reparatur strahlenbedingter DNS-Schäden veränderlich ist. Ursachen der Schadensheterogenität wurden diskutiert. Methodik: 5 Probanden wurde Blut entnommen. Unter Verwendung des alkalischen Comet-Assay wurde der DNS-Schaden von je 200 Blutleukozyten pro Faktor und Proband ermittelt. Als Parameter für Schadensheterogenität wurde die Varianz des Schädigungsmittels und eine mittelwertkorrigierte Schädigungsvarianz (Quotient aus Schädigungsvarianz und Schädigungsmittelwert) bestimmt, pro Faktor über n=5 Probanden gemittelt und dann bezogen auf die einzelnen Faktoren mit einfaktorieller ANOVA verglichen, Unterschiede wurden unter einer Schwelle von α Ergebnisse: Nach der Entfernung von Histonproteinen durch Lyse vor Bestrahlung war die Schadensvarianz signifikant größer als in Zellen, die vor Bestrahlung eine intakte Chromatinstruktur aufwiesen. Durch Zusatz von 90 mM DMSO-Lösung als Antioxidanz zur Lyselösung wurde das Niveau der Schadensvarianz auf das von in intaktem Zustand bestrahlten Zellen reduziert. Ein- und mehrfache Bestrahlung vergrößerten signifikant die Varianz des Schädigungsmittels, während Residualschaden nach ein- bzw. zweifacher Bestrahlung und Reparatur eine signifikant kleinere Varianz als Initialschaden zeigte. Insgesamt korrelierten Schädigungsmittel und -varianz hochgradig miteinander. Auf mittelwertkorrigierte Schädigungsvarianzen zeigten nur mehrfache Bestrahlung und Reparatur signifikante Effekte. Diskussion/Thesen: Schadensheterogenität ist mit dem Comet-Assay diskriminierbar. Heterogenität von DNS-Initialschaden einer Normalzellpopulation im Comet-Assay wird nicht durch interzelluläre Differenzen der Konzentration löslicher Antioxidantien bedingt, sondern ist Produkt chromatinmodulierter quantitativer Schadensunterschiede, bzw. der durch den DNS-Packungsgrad und vor allem den Schadensgrad beeinflussten Messbarkeit des Schadens mit dem Comet-Assay. Gegen Einflüsse des Schadensmittels stabilere Parameter, z.B. mittelwertkorrigierte Varianzen des Schädigungsmittels, sind bessere Parameter zum Vergleich der Schadensheterogenität zweier Zellpopulationen.

Purpose: The comet assay measures DNA damage on a single cell basis. Within this assay cells of one population differ in their level of DNA damage. Aim of this study was to examine whether this heterogeneity of DNA damage can be altered by variation of different factors (i.e. chromatin structure/content of histone proteins, concentration of soluble antioxidants, radiation, repair of DNA damage) and to discuss causes of heterogeneity. Methods: Blood samples of 5 donors were collected. Using the alkaline comet assay DNA damage in %tail-DNA was determined for 200 leukocytes per factor and donor. As measures for heterogeneity the damage variance and the mean-corrected variance (quotient of damage variance and mean of damage) were determined per factor and donor, averaged for n=5 donors and mutually compared by means of ANOVA (level of significance α Results: After removal of histone proteins before irradiation damage variance was significantly higher than in intact irradiated cells. If 90 mM DMSO was added as an antioxidant to the lysis solution before irradiation the damage variance was not significantly different from intact cells. After irradiation with 4 Gy or 2x4Gy damage variance was increased compared to basal damage while residual damage after single or double irradiation and repair showed a significantly smaller damage variance than initial damage. Overall, mean of damage and damage variance were highly correlated with each other. On mean-corrected damage variance - a measure that is more resistant against changes of mean of DNA damage - only double irradiation and repair showed a significant effect. Conclusion: In the comet assay damage heterogeneity can be discriminated. Heterogeneity of initial DNA damage of a leukocyte population in the comet assay seems not to be caused by intercellular differences of antioxidant concentration. It rather is a result of chromatin/histone modulated quantitative damage differences or of the measurability of this damage dependent on DNA-packaging and the degree of damage. Measures that are more resistant against changes of mean of DNA damage, e.g. the mean-corrected variance might be better parameters to compare damage heterogeneity between cell populations.