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| 4207 The zebrafish embryo (Danio rerio) has developed as a popular model organism in various research fields. In the European Union the early developmental stages are a promising alternative to animal testing reducing ethical concerns. One important application is in the risk assessment of chemicals to aquatic organisms in ecotoxicology and drug discovery research. Understanding and predicting toxicokinetic (TK) processes is an essential step towards replacing animal tests with the zebrafish embryo. TK comprises the ADME processes of xenobiotics: absorption distribution metabolism and elimination. Systematic understanding and prediction of the accumulation of xenobiotics in specific tissue and organs in the zebrafish embryo are still missing. It was first aimed to develop a method and data analysis workflow of mass spectrometry (MS) imaging for the zebrafish embryo taking morphological information into account and focusing on data reproducibility. Secondly the MS imaging results should be underlined with mechanistic description of the accumulation patterns of the xenobiotics in the zebrafish embryo. MS imaging methods were successfully applied to study TK processes of xenobiotics in the zebrafish embryo. The focus was placed on the two techniques matrix-assisted laser desorption/ionization-MS (MALDI-MS) imaging and especially laser ablation inductively coupled plasma MS (LA-ICP-MS). For LA-ICP-MS a workflow consisting of the ablation of whole embryos with carbon as an internal standard was developed. Reproducibility including biological variation was shown with Kernel density estimates. Furthermore the workflow was advanced presenting the software FishImager. FishImager processes MS imaging data performs clustering of the data and imports biological features (such as eyes yolk) as regions of interest (ROI). The intensities and amounts are visualized in heatmaps making statistical information per ROI and cluster easily visible. FishImager significantly reduces the data analysis time and allows objective data processing to go beyond a subjective visual inspection of the data. It will be a useful tool for zebrafish embryo research. The spatial distribution of xenobiotics was investigated targeting different physico-chemical and biological processes. MS imaging was combined with bulk analysis and toxicity measurements. A mechanical sample preparation separating the yolk from the rest of the zebrafish embryo (termed the embryonic body) was developed to investigate the sorption of xenobiotics to the yolk and embryonic body. By this we could demonstrate that five selected neutral chemicals preferentially accumulated in the yolk. The extent of the accumulation increased with increasing hydrophobicity. Looking at internal concentrations in the whole embryo and relating them to toxic effects e.g. neurotoxicity would overestimate the target site’s concentration. We could highlight this by studying the spatial distribution of a bromine-containing acetylcholinesterase (AChE) inhibitor. LA-ICP-MS was applied following the bromine distribution as a marker for the compound. The spatial distribution of bromine in the head and spine likely reflected the localization of the tissue rich in AChE. The quantitative imaging significantly correlated with the measured decline in AChE activity in the embryos. Our studies also pointed out that processes other than simple passive diffusions such as metabolism transporter proteins and dynamic development are presumably affecting the distribution and steady-state establishment in the zebrafish embryo. More quantitative description is urgently needed. Biotransformation of several of the here selected compounds occurred. Different tissues were shown to likely transform the parent compounds. These are first of all the expected important organs liver and kidney but also the whole gastrointestinal tract and yolk or yolk syncytial layer. We could localize one compound in the middle of the GI tract with MALDI-MS imaging. We confirmed that the organic anion transporter Oatp1d1 is mediating the transport of this compound. But also developmental changes might be a reason for the local accumulation. The presented MS imaging workflows can be applied to more xenobiotics. First mechanistic understanding of tissue-specific accumulations can be extended and particular processes investigated in more depth. This can improve the knowledge and prediction of the ADME processes and increase the application of the model organism the zebrafish embryo. | |
| Der Zebrabärblingsembryo (Danio rerio) hat sich zu einem beliebten Modellorganismus in verschiedenen Forschungsbereichen entwickelt. In der Europäischen Union sind die embryonalen Entwicklungsstadien eine vielversprechende Alternative zu Tierversuchen wodurch ethische Bedenken verringert werden. Eine wichtige Anwendung des Zebrabärblingsembryos liegt in der Risikobewertung von Chemikalien für aquatische Organismen in der Ökotoxikologie und Pharma-Wirkstoffforschung. Das Verständnis und die Vorhersage toxikokinetischer (TK) Prozesse ist ein wesentlicher Schritt um Tierversuche durch den Zebrabärblingsembryo zu ersetzen. TK beinhaltet das ADME-Prinzip von Xenobiotika: Absorption Verteilung Metabolismus und Eliminierung. Ein systematisches Verständnis und eine Vorhersage der Akkumulation von Xenobiotika in bestimmten Geweben und Organen im Zebrabärblingsembryo fehlen noch. Ziel war erstens die Entwicklung einer Methode und eines Datenanalyse-Workflows für die massenspektrometrische (MS) Bildgebung für den Zebrafisch-Embryo. Dies sollte unter Berücksichtigung morphologischer Informationen und mit Fokus auf die Reproduzierbarkeit der Daten erfolgen. Zweitens sollten die MS-Imaging-Ergebnisse mit einer mechanistischen Aufklärung und Quantifizierung der Anreicherung ausgewählter Xenobiotika untermauert werden. In dieser Arbeit wurden Verfahren der MS Bildgebung für den Zebrabärblingsembryo entwickelt und erfolgreich angewendet um TK-Prozesse von Xenobiotika zu untersuchen. Der Fokus lag dabei auf den beiden Techniken der Matrix-unterstützten Laser-Desorptions/Ionisation-MS (MALDI-MS) Bildgebung und insbesondere der Laserablation induktiv gekoppelter Plasma-MS (LA-ICP-MS). Für die LA-ICP-MS wurde ein Arbeitsablauf entwickelt der aus der Ablation ganzer Embryonen mit Kohlenstoff als interner Standard besteht. Die Reproduzierbarkeit einschließlich der biologischen Variation wurde mit Kernel-Dichteschätzungen gezeigt. Weiterhin wurde der Workflow weiterentwickelt und die Software FishImager vorgestellt. FishImager verarbeitet MS-Bilddaten führt ein Clustering der Daten durch und importiert biologische Merkmale (z. B. Augen Dotter) als „regions of interest“ (ROI). Das Ergebnis wird farblich in Heatmaps visualisiert die statistische Informationen pro ROI und Cluster leicht sichtbar machen. FishImager reduziert die Datenanalysezeit erheblich und ermöglicht eine objektive Datenverarbeitung die über eine subjektive visuelle Inspektion der Daten hinausgeht. Untersucht wurde die räumliche Verteilung von Xenobiotika unter Berücksichtigung verschiedener physikalisch-chemischer und biologischer Prozesse. Die MS-Bildgebung wurde mit Bulk- Analysen und Toxizitätsmessungen kombiniert. Eine mechanische Probenpräparation die den Dotter vom Rest des Zebrabärblingsembryos (Embryonalkörper) trennt wurde entwickelt um die Sorption von Xenobiotika an Dotter und Embryonalkörper zu untersuchen. Dabei konnten wir zeigen dass fünf ausgewählte neutrale Chemikalien bevorzugt im Dotter akkumulierten. Die Anreicherung nahm mit zunehmender Hydrophobizität zu. Daher würde die Betrachtung der internen Konzentrationen im gesamten Embryo die Konzentration am Zielort z.B. Nervengewebe im Fall von Neurotoxizität überbewerten. Wir konnten dies anhand der Untersuchung der räumlichen Verteilung eines Acetylcholinesterase (AChE)-Inhibitors verdeutlichen. LA-ICP-MS wurde angewandt um die Bromverteilung als Marker für den bromierten AChE Inhibitor zu untersuchen. Die räumliche Verteilung von Brom in Kopf und Wirbelsäule spiegelte wahrscheinlich die Lokalisation des AChE-reichen Gewebes wider. Die quantitative Bildgebung korrelierte signifikant mit dem gemessenen Rückgang der AChE-Aktivität in den Embryonen. Unsere Untersuchungen wiesen auch darauf hin dass vermutlich andere Prozesse als einfache passive Diffusion wie Metabolismus Transporterproteine und dynamische Entwicklung die Verteilung und die Etablierung des Steady-State im Zebrabärblingsembryo beeinflussen. Eine genauere qualitative und quantitative Beschreibung ist dringend erforderlich. Es fand eine Biotransformation von mehreren der hier ausgewählten Verbindungen statt. Es wurde gezeigt dass verschiedene Gewebe die Ausgangsverbindungen wahrscheinlich transformieren. Dies sind in erster Linie die erwarteten wichtigen Organe Leber und Niere aber auch der gesamte Gastrointestinaltrakt und der Dotter bzw. die Dottersackschicht. Weiterhin konnten wir eine Verbindung in der Mitte des GI-Trakts mit MALDI-MS lokalisieren. Wir stellten die Hypothese auf und bestätigten dass der organische Anionentransporter Oatp1d1 den Transport dieser Verbindung vermittelt. Aber auch entwicklungsbedingte Veränderungen könnten ein Grund für die lokale Anreicherung sein. Die vorgestellten MS Bildgebungsverfahren können auf weitere Xenobiotika angewendet werden. Das erste mechanistische Verständnis von gewebespezifischen Akkumulationen kann erweitert und bestimmte Prozesse tiefergehend untersucht werden. Diese können das Wissen und die Vorhersage der ADME-Prozesse verbessern und die Anwendung des Modellorganismus des Zebrabärblingsembryos erhöhen. |
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