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| Zur Erfassung hormonaktiver Wirkungen von Substanzen auf Fische sind unter Regie der OECD eine Reihe von Testrichtlinien validiert worden die in das harmonisierte Prüfrichtlinien-Programm für Endokrine Disruptoren (OECD 2010) eingegliedert sind. Die Untersuchung von physiologischen suborganismischen Parametern im Rahmen dieser Tests ist begrenzt auf etablierten Biomarker wie Vitellogenin oder 11-keto Testosteron in Blutplasma oder Lebergewebe. Ein vielversprechender Ansatz zur Verfeinerung bestehender Testrichtlinien ist die Integration molekularer Endpunkte da diese sehr schnell auf Schadstoffe reagieren. Durch die Aufklärung von Zusammenhängen mit den auslösenden Ereignissen (der initialen Wirkung) der Schadsubstanz können sie indikativ für mögliche adverse Effekte auf Organismen sein. Dies entspricht dem Konzept Adverse Outcome Pathway (AOP) das als Weiterentwicklung der "Toxicity Pathways" als Interpretationshilfe für die Risikobewertung dienen soll. Hierbei werden die Zusammenhänge zwischen einem initialen molekularen Ereignis (Molecular Initiating Event; MIE) und dem daraus resultierenden apikalen Endpunkt auf der Organismus- oder Populationsebene auf eine einfache Kette von Schlüsselereignissen herunter gebrochen. Die so identifizierten Wege können die Basis für effektivere Bewertungsstrategien für toxische Substanzen einschließlich endokrin wirksamer Substanzen (Endocrine Disrupting Chemicals; EDC) bilden und die Entwicklung von passenden Prüfstrategien erleichtern. In der hier präsentierten Proof-of-Principle-Studie wurden die Effekte der Exposition mit dem nicht-steroidalen Aromatase-Inhibitor Fadrozol (Testkonzentrationen 10 μg/L 32 μg/L 100 μg/L) in einem Fish Sexual Development Test (FSDT; OECD TG 234) mit Zebrabärbling (Danio rerio) untersucht. Dieser Test wurde durch Genexpressionsanalysen zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Entwicklung (48 hpf 96 hpf 28 dpf 63 dpf) ergänzt. Das Ziel der Studie war die Identifikation von molekularen Endpunkten die durch Aromatase-Inhibition beeinflusst werden und einen adversen Effekt auf der Populationsebene auslösen. Zu den beobachteten Effekten zählte eine vollständige Verschiebung des Geschlechterverhältnisses in Richtung Männchen sowie eine erhöhte Gonadenreife der männlichen Tiere bereits in der niedrigsten Testkonzentration. Diese Effekte wurden auf die spezifische Wirkweise von Fadrozol zurückgeführt. Durch das MIE der Inhibition der Aromatase-Aktivität wird der Umbau von C19-Androgenen zu C18-Östrogenen verhindert und somit das Verhältnis der Steroidhormone die das Geschlechterverhältnis regulieren verändert. Eines der direkt folgenden molekularen Schlüsselereignisse (Molecular Key Event; KE) war anhand der Studienergebnisse die Herabregulation der direkt Östrogen-sensitiven Gene vtg1 und cyp19a1b bereits nach 48 hpf die außerdem in unterschiedlichem Maße geschlechtsdimorphe Expression bei 63 dpf zeigten. Neben diesen beiden Genen wurden drei weitere potenzielle Biomarker–Gene identifiziert die an unterschiedlichen Schlüsselstellen des Steroidsignalweges eingreifen: igf1 (Insulin-like growth factor 1; Transkriptionsregulation) lss (Lanosterol synthase; Umbau von Fettsäuren zu Cholesterol) und star (Steroidogenic acute regulatory protein Transport von Cholesterol zur inneren Mitochondrienmembran). Diese Markergene ermöglichen einen umfassenderen Einblick in die zugrunde liegenden Mechanismen der Aromatase-Inhibition während der sexuellen Entwicklung von Fischen. Darüber hinaus konnte der bereits existierende AOP der Aromatasehemmung speziell auf die Geschlechtsentwicklung von Fischen angepasst werden. Auf Basis der vorgestellten Ergebnisse ist die Anwendung von Genexpressionsanalysen im Rahmen von etablierten Testmethoden und Verfahren zu diskutieren. Anwendungsmöglichkeiten bieten der Fish Embryo Test (Erweiterung mit Genanalysen hin zu einem Screening Werkzeug für EDCs) die Erweiterung von etablierten chronischen Tests zur Untersuchung von Substanzen mit unbekannter Wirkweise sowie ein Einsatz für das Biomonitoring zum wirkorientierten Nachweis von Schadstoffeinwirkungen in biologischen Matrices. | |
| For the evaluation of effects of hormone-active substances to fish several test guidelines have been validated by the OECD which are included in the Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disruptors (OECD 2010). In these tests the assessment of physiological parameters is limited to the established biomarkers like vitellogenin or 11-keto testosterone in blood plasma or liver tissue. A promising approach to refine existing testing strategies is the integration of molecular endpoints which rapidly respond to exposure. Furthermore these endpoints can be indicative of potential adverse effects at the organismal level by providing information which connect to the initiating effect of a substance. This is in line with the concept of Adverse Outcome Pathways (AOP) which evolved from the "toxicity pathway" approach as a mechanistic evaluation tool for the risk assessment. An AOP describes the linkage between a molecular initiating event (MIE) and the adverse outcome at apical level by a simplified sequence of key events at different levels of organization. Identified AOPs can provide the basis for the development of more effective and reliable toxicity testing and evaluation strategies also for endocrine disrupting chemicals (EDC). The present proof-of-principle study investigated the effects of the non-steroidal aromatase inhibitor fadrozole (test concentrations: 10 μg/L 32 μg/L 100 μg/L) on zebrafish (Danio rerio) in a Fish Sexual Development Test (FSDT; OECD TG 234). The FSDT was combined with gene expression analyses at different developmental time points (48 hpf 96 hpf 28 dpf 63 dpf). The purpose was to define molecular endpoints which are affected by aromatase inhibition and result in adverse apical effects. Observed apical effects of fadrozole during the sexual development of fish comprised a complete shift of the sex ratio towards males and accelerated maturation of male gonads already at low concentrations. These effects were attributed to the mode of action of fadrozole. The MIE of fadrozole to specifically inhibit the activity of aromatase led to an inhibition of the conversion of C19-androgens to C18-estrogens and thus to an imbalance of the sex steroid hormones controlling the sex ratio. One of the subsequent molecular key events (KE) identified by the study was the down regulation of estrogen-responsive genes like vtg1 and cyp19a1b as early as 48 hpf and which showed sexdimorphic expression patterns at 63 dpf. In addition to these two genes three other genes were defined as potential biomarkers which represent key processes along the steroidogenesis signalling pathway: igf1 (insulin-like growth factor 1; transcription regulation) lss (lanosterol synthase; conversion of fatty acids to cholesterol) and star (steroidogenic acute regulatory protein transport of cholesterol to the inner mitochondrial membrane). These marker genes allow a more in-depth insight into the underlying mechanisms of aromatase inhibition during sexual development in fish. Moreover the existing AOP for aromatase inhibition could be refined specifically for the sexual development of fish. Based on the results of this study the integration of gene expression analysis in established test guidelines should be discussed. Possible applications include an implementation in the fish embryo test as a screening tool for EDCs secondly an extension of chronic fish tests for the assessment of substances with unknown mode of action and finally the use for monitoring purposes to analyse the aftermath of pollution impacts in biological matrices in an effect directed approach. |
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