Titelaufnahme

Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung zellulärer Reaktionen auf die Induktion rekombinanter Gene in Fed-batch Prozessen mit Escherichia coli, wobei auch Einflüsse der Maßstabvergrößerung biotechnologischer Prozesse mit rekombinanten Mikroorganismen auf die Produktivität und die Zellphysiologie berücksichtigt werden. Als Modellsystem wurde im Rahmen dieser Arbeit ein rekombinanter Fed-Batch-Prozeß zur Produktion von α-Glucosidase ausgewählt. Dieser Prozeß wurde in Bezug auf Wachstum, Zellsegregation, Plasmidstabilität, und Produktbildung charakterisiert. Darüber hinaus wurden jedoch auch Veränderungen der Substrataufnahme, des Nukleotidpools, des Proteinmusters, sowie der Einfluß der Induktion auf die Expression verschiedener mRNA's untersucht. Die am α-Glucosidase-Prozeß gewonnenen Ergebnisse wurden mit zwei weiteren rekombinanten Prozessen verglichen (Creatinin-Iminohydrolase, ZZ-Protein), um Faktoren zu evaluieren, die verschiedene rekombinante Prozesse voneinander unterscheiden. Aus grundlagenorientierter Sicht hat die Arbeit folgende wichtige Nachweise geliefert: Nach Induktion rekombinanter α-Glucosidase kommt es zu einer Inhibition verschiedener zellulärer Prozesse. Als Folge davon kommt es zu einer Deregulation der Plasmidreplikation, mit der Folge einer 3-6-fachen Plasmidamplifikation. Das Phänomen der Plasmidamplifikation nach Induktion ist nicht auf den α-Glucosidase-Prozeß beschränkt, sondern tritt in allen Systemen auf, bei denen die Produktbildung mit einer starken Inhibition des Wachstums einhergeht. Die Entstehung nicht-teilungsfähiger Zellen nach Induktion der α-Glucosidase ist eine Folge der Last der Produktsynthese auf den Syntheseapparat der Zelle. Es konnte mittels Elektronenmikroskopie gezeigt werden, daß die nicht-teilungsfähigen Zellen durch eine Ausdehnung des Chromosoms gekennzeichnet sind. Diese Zellen stellen eine metabolisch absterbende Population dar, die jedoch über einen längeren Zeitraum nicht lysiert und in der über längere Zeit noch bestimmte metabolische Aktivitäten nachgewiesen werden können. In diesem Zusammenhang wird diese Population als viable but non-culturable (VBNC-Status) diskutiert. Die starke Induktion rekombinanter Proteine führt zu einer Inhibition der Glucoseaufnahmekapazität der Zellen. Diese Eigenschaft kann in Abhängigkeit von den Prozeßbedingungen problematisch in industriellen Prozessen sein, da die im Wachstumsmedium akkumulierende nichtmetabolisierte Glucose das Überwachsen der Kultur durch plasmidfreie nichtproduzierende Zellen begünstigt. Im Rahmen der Arbeit wurde eine on-line nutzbare Methode zur schnellen Bestimmung der Glucoseaufnahmekapazität entwickelt, auf deren Basis eine optimale Regelung des Glucose-Feedings möglich ist. Im Rahmen der Arbeit wurden die zellulären Alarmone ppGpp, σS und cAMP in Abhängigkeit von der Stärke der Glucoselimitation und der Wachstumsrate gemessen. Es konnte gezeigt werden, daß nach Induktion der α-Glucosidase im Fed-Batch-Prozeß die Konzentrationen der Regulatoren der zellulären Adaptationssysteme an Glucoselimitation (ppGpp und σS) reduziert sind, im Vergleich zu Kulturen ohne Induktion. Nach Überexpression der α-Glucosidase kommt zu einem Abfall der zellulären Konzentrationen von ppGpp, σS und der extrazellulären cAMP-Konzentration. Untersuchungen, die in diesem Zusammenhang mit verschiedenen Mutanten durchgeführt wurden, lassen vermuten, daß das Absterben der Zellen nach Induktion mit der fehlenden Adaptation an die Streßbedingungen in Zusammenhang steht. Im Unterschied zum α-Glucosidase-Prozeß wurde im zweiten untersuchten System zur Produktion von Creatinin-Iminohydrolase (CRIMI) keine Wachstumsinhibition und keine Plasmidamplifikation nach Induktion beobachtet, obwohl das Produkt in höherer Konzentration (>30% vom Gesamtzellprotein) als die α-Glucosidase mit höherer spezifischer Rate gebildet wurde. Weiterhin kommt es nach Überexpression von CRIMI zu einem starken Anstieg der zellulären s S-Konzentration und zu einer kontinuierlichen Akkumulation von cAMP im Kulturmedium. Obwohl im Rahmen der Dissertation die molekulare Basis der unterschiedlichen Reaktion beider Systeme nicht experimentell geklärt wurde, werden im Diskussionsteil der Arbeit Hypothesen im Zusammenhang mit der Konkurrenzsituation auf Ebene von Transkription und Translation zwischen Produktsynthese einerseits und zellulären Synthesen andererseits, diskutiert. Mittels einer Scale-down Strategie wurden Zonen mit unterschiedlicher Konzentration von Glucose imitiert, die beim Up-scaling von bakteriellen Fermentationsprozessen entstehen und untersucht, in wieweit sich Oszillationen der Kohlenstoffquelle auf die mikrobielle Physiologie und die Produktbildung auswirken. Die Ergebnisse belegen, daß oszillierender Glucosehunger die Produktbildung in rekombinanten Prozessen beeinflußt. Dies betrifft sowohl die Produktausbeute, als auch die Physiologie der kultivierten Zellen. Ein unerwartetes Ergebnis der Untersuchung war, daß sich oszillierender Glucosehunger wahrscheinlich vorrangig positiv auf den Prozeßverlauf auswirkt. Möglicherweise stellen regelmäßige Oszillationen ein schwaches Streßsignal dar, das eine entsprechende Adaptation der Zellen auslöst und sie resistenter macht gegen den starken Streß, den die Produktion des rekombinanten Produktes darstellt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Prozeßfaktoren evaluiert, die die Maßstabsvergrößerung rekombinanter biotechnologischer Prozesse beeinflussen. Diese Studien wurden im Rahmen des Europrojektes "Bioprocess Scale-up Strategy - based on Intergration of Microbial Physiology and Fluid Dynamics" durchgeführt, das neben der biologischen Charakterisierung auch die Entwicklung entsprechender Simulationsprogramme auf der Grundlage von Kompartimenten und Fluid Dynamics in oszillierenden Umgebungen, sowie die Large-Scale-Verifizierung im nicht rekombinanten Wildtyp E. coli W3110 und in einem rekombinanten Prozeß (ZZT2-Protein) beinhaltet. Es konnte durch umfassende Analysen gezeigt werden, daß die Vermischung im Großreaktor, insbesondere auftretende Glucose- und Sauerstoff-Gradienten die Zellphysiologie und Produktbildung beeinflussen.

This thesis concerns the investigation of cell growth, plasmid stability and amplification, recombinant protein overproduction, cellular metabolism, and several stress responses after induction in glucose limited fed-batch recombinant cultures. The extensive study was specifically focused on one process for production of a yeast α-glucosidase in E. coli RB791 by derepression of the Ptac promoter with IPTG. This investigation was also compared to other model systems, including CRIMI (creatinine imino hydrolase) in a small scale cultivation and ZZ protein (a modified domain B of staphylococcal protein A) in a large-scale process. Induction of α-glucosidase formation led to an inhibition of cell growth and glucose uptake. The growth inhibition was connected to a decrease of the colony forming ability of the cells, which declined to approximately 5 % within 4 h after induction in the strain with coexpression of argU-tRNA. The non-culturable cells were shown to have not lost all metabolic activities, and even succeed to maintain some glucose uptake and respiratory ability. The ability of these cells for replication is apparently not only impaired by competition of the synthesis of the recombinant product to the formation of cellular house-keeping proteins, but specifically by continued damage of the chromosomal DNA or loss of superhelicity. The cells are unable to induce the SOS response, as the product formation occupies a large part of the protein synthesis machinery, and consequently the cells loose their ability to recover irrevocably. This model of the inability of cells to have not the opportunity to respond to DNA damage is new in view of recombinant protein production. Furthermore, up-growth of plasmid-free cells was observed in the α-glucosidase process. The maximal glucose uptake capacity decreased to only about 25 % of the qsmax of the batch phase. Reduction of qsmax may be a serious problem in recombinant fed-batch processes, because it results in overfeeding of substrate which in a turn supports the up-growth of plasmid-free cells and therefore lowers the productivity. After induction, the recombinant plasmid pKK177glucC was amplified by a factor of three to five. The plasmid copy number increased from about 100 to 300-400 per cell within a period of six hours in glucose-limited fed-batch cultivations. In contrast, no amplification occurred if product formation was not induced. Cultures with the same E. coli strain, but other recombinant ampicilline based plasmids, were also overgrown by plasmid-free cells, when the growth was inhibited by overexpression of the recombinant genes, but showed no up-growth of plasmid-free cells and no plasmid amplification when product formation did not inhibit growth. Glucose limited fed-batch cultivations of Escherichia coli cells are characterized by a transient increase of the stringent response regulator ppGpp (guanosine-3’,5’-bisphosphate), a higher concentration of the general stress response regulator σS and an accumulation of extracellular cAMP during the shift from unlimited to limited growth. The influence of the overexpression of recombinant genes on the concentration of these stress regulators was compared in different expression systems. It has been shown that the response can be different in dependence on the recombinant gene. In case of the α-glucosidase process, no general stress response was induced, and the concentration of the three regulators (ppGpp, σS and cAMP) decreased to very low levels. In contrast, induction of the recombinant CRIMI caused a strong increase of σS and continuous accumulation of cAMP in the cultivation medium. Although the different products were accumulated to similar levels in these various systems, significant differences were also detected in connection to the influence of the recombinant production on the cellular growth and cell survival. The results suggest that induction strength on the transcriptional level and the strength of the ribosome binding site, but specifically the gene codon usage of a recombinant gene influence the behavior of stress signals. The small scale process of α-glucosidase was also investigated by a down-scale procedure, where glucose oscillations were created by an on/off feeding mode in either short cycles (1 min) or long cycles (4 min). The influence of repeated short-term glucose starvation on the cell death rate, product stability, and up-growth of plasmid-free cells was concluded from investigation of a number of general and specific process parameters. Although the glucose uptake capacity was inhibited in all cultures performed, the up-growth of plasmid-free cells in the culture was strongly inhibited by fast oscillations. In connection to product formation the initial α-glucosidase accumulation was the same in all cultures, but the stability of the product was significantly lower in the cultivation with long cycles, possibly because of a higher stress level. Finally, a study of cell growth kinetics and physiology during large-scale (12 m3 / 30 m3) fermentation of E. coli W3110 including a recombinant ZZ protein process was performed within a EU network project. The data obtained from the large-scale processes demonstrate the existence of gradients for glucose and oxygen and show the effect of mixing on cell growth and product formation.