Der Inhalt dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Optimierung diagnostischer Enzyme mit Methoden des evolutionären Proteindesign. Im ersten Teil wird eine neue Methode der homologen in vitro Rekombination vorgestellt, welche aus fünf Schritten besteht: (1) Synthese Uracil-DNA-haltiger DNA (U-DNA) von den Elterngen-Sequenzen, (2) Synthese von DNA-Fragmenten mittels einer Kettenabbruchreaktion mit Didesoxynukleotiden und mit U-DNA als Template, (3) Abbau der Template-U-DNA, (4) Reinigung der DNA-Fragmente und (5) Reassemblierung der Fragmente mit gleichzeitigem Abbau der terminierenden Didesoxynukleotide. Die Funktionsfähigkeit der entwickelten Methode wurde durch Rekombination von zwei Genen der Alkalischen Phosphatase und anschließende Sequenzdatenanalyse überprüft. Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt die Erhöhung der thermischen Stabilität der Creatinase aus Erwinia sp. unter Beibehaltung der katalytischen Effizienz. Diese Optimierung umfasste zwei Zyklen fehlerhafter PCR mit anschließendem Screening auf thermische Stabilität und auf Enzymaktivität bei Substratlimitation. Anschließend wurden die Aminosäuren an den identifizierten Positionen permutiert. Die finale Mutante CTsd7 unterschied sich in ihrem apparenten Schmelzpunkt um 8 °C vom Wildtyp.
|